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              離子交換柱層析操作步驟
            1. 發布日期:2014-04-09      瀏覽次數:3441
              •    1.裝柱:
                  1.1 取出層析柱,用去離子水沖洗干凈,連接好管子后固定柱子;
                  1.2用水沖洗層析柱3-5次,每次10ml去離子水;
                  1.3取出填料,靜止至室溫后,根據需要用移液器取出3-5ml的填料進行裝柱;
                  1.4用去離子水沖洗填料5個柱體積;
                  2.柱的平衡與上樣:
                  2.1用0.02M TB bufferA 緩沖液(PH7.6)平衡Ni柱,直至流出液的pH為7.6; 2.2對處理的樣品進行過濾后,緩慢上樣讓蛋白充分結合;
                  3.洗雜蛋白:
                  3.1用0.02M TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,清洗沒有結合到層析柱上的雜蛋白,至流出液與緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含10mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含20mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含40mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含60mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含80mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  3.7用含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  (具體的洗脫梯度需根據實驗自行調整)
                  4.解離目的蛋白:
                  4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含100mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含200mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含500mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 緩沖液(PH7.6)過柱,共洗約30ml,至流出液與含1000mMNaCL的TB bufferA 緩沖液的OD值接近為止,流出液取20ul做SDS-PAGE檢測;
                  (具體的洗脫梯度需根據實驗自行調整)
                  5.柱的清洗與保存:
                  5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA緩沖液(PH7.6)以沖洗層析柱,共沖洗30ml; 5.2用濃度為1.5M的NaCl溶液沖洗層析柱,共沖洗30ml; 5.3用過濾去離子水沖洗50ml;
                  5.4用20%乙醇沖洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
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